Ферментативная иммунохроматография также потенциально может широко применяться для диагностики на дому и в кабинете врача. Этот метод предназначен для определения гаптенов, которые в настоящее время в основном определяют с помощью конкурентных методов иммуноанализа. Ферментативная иммунохроматография напоминает иммуноанализ с ферментативным усилением, однако между ними есть и существенные отличия.
В методах типа EMIT гаптен и конъюгатгаптен - фермент конкурируют между собой за ограниченное количество антител против определяемого соединения. Связывание конъюгата с антителом приводит к изменению ферментативной активности. В общем случае свободный конъюгат активен, а в комплексе с антителом неактивен. Таким образом, чем больше определяемого соединения находится в образце, тем большая доля конъюгата останется несвязанной и тем более высокой будет ферментативная активность.
В ферментативной иммунохроматографии также используются конъюгат фермента с определяемым веществом и специфические антитела против последнего. Однако в отличие от EMIT здесь определение не связано с изменением активности конъюгата в комплексе с антителом. Принцип метода ферментативной иммунохроматографии представлен на рис. 6.4. Определенный объем пробы смешивают с раствором, содержащим конъюгат фермент - гаптен и соответствующий ферментный реагент. В рассматриваемом примере сопряженным ферментом является пероксидаза из корней хрена, а ферментным реагентом - глюкозооксидаза. Глюкозооксидаза при окислении глюкозы генерирует пероксид водорода - субстрат пероксидазы, в результате чего отпадает необходимость включать в состав наборов нестабильные пероксидные реагенты. Сухую полоску фильтровальной бумаги с иммобилизованными на ней антителами против определяемого вещества помещают в раствор пробы и других реагентов. Реагирующие вещества под действием капиллярных сил поднимаются по полоске вверх. Глюкозооксидаза распределяется по длине полоски равномерно, а высота подъема определяемого вещества и конъюгата зависит от их относительных концентраций. После инкубации в течение нескольких минут полоску переносят в проявляющий раствор, состоящий из глюкозы и хромогенного индикатора. В ходе ферментативной реакции образуется окрашенная зона, высота которой пропорциональна концентрации определяемого вещества в пробе. Следовательно, здесь конъюгат используется только в качестве маркера для определения длины пробега определяемого вещества по полоске, а активность фермента при связывании конъюгата с антителом не изменяется.
Для определения теофиллина с помощью ферментативной иммунохроматографии требуется около 15 мин. Чувствительность, специфичность и точность анализа сравнимы с соответствующими характеристиками метода EMIT. Для проведения анализа не требуется никаких приборов, окрашенная полоска стабильна в течение года при хранении в темноте. Метод можно применять для анализа проб крови, если к первому раствору добавить агент, агглютинирующий эритроциты, например антисыворотку барана. До настоящего времени положительный контроль в таких аналитических системах не применялся.
