Объекты и методы исследования.
Объектами исследования служили: 1) представители позвоночных - крысы Ratus norvegicus линии Wistar; 2) куры породы русская белая «Леггорн»; 3) представители беспозвоночных - пресноводный двустворчатый моллюск Anodonta cygnea; 4) культура клеток миобластов куриных эмбрионов; 5) фибробластоподобная культура клеток линии Swiss 3T3; 6) культура клеток, трансформированная из нормальных фибробластов линии Е1А+сНа-ras (клетки, впадающие в апоптоз) и E1A+E1B (клетки, не впадающие в апоптоз).
Методы.
В работе использован широкий спектр физиологических, биохимических и фармакологических методов:
- выделение фракций плазматических мембран мышечной ткани позвоночных и беспозвоночных животных с использованием метода дифференциального центрифугирования (Kidwai et. al., 1973 с нашими модификациями);
- выделение частично очищенных мембранных фракций культуры клеток миобластов куриных эмбрионов, фибробластоподобных клеток линии Swiss 3T3, E1A+cHa-ras, E1A+E1B (Плеснёва и др., 1999; 2003);
- выделение фракции, содержащей примембранную форму цАМФ-ФДЭ (Houslay, 1985).
- определение активности АЦ с использованием радиоактивного субстрата АЦ реакции - [α32P]АТФ (Salomon et al., 1974 с некоторыми модификациями);
- определение активности цАМФ-ФДЭ, с использованием радиоактивного субстрата [3H]цАМФ (Ткачук и др., 1978);
- АДФ-рибозилирование гетеротримерных G-белков холерным и коклюшным токсинами (Pertseva et al., 1992);
- электрофорез в ПААГ
- иммуноблотинг с использованием моноклональных антител для идентификации изоформы ПКСζ;
- определение ростстимулирующей активности действия инсулина, ИФР-1, ЭФР и цАМФ по включению [14C] тимидина в ДНК культуры клеток Swiss3T3 (Баркан и др. 1992; Плеснёва и др., 1997; 1999);
- использование модели апоптоза на трансформированных клетках, полученных из нормальных эмбриональных фибробластов введением пары комплементирующих онкогенов E1A+cHa-ras, обладающих высокой проапототической чувствительностью к удалению ростовых факторов (Bulavin et.al., 1999) и ее характеристика (Плеснёва и др., 2003);
- оценка антиапоптотического действия инсулина, ИФР-1 и цАМФ с использованием метода клоногенной выживаемости культуры клеток E1A+cHa-ras (
Плеснёва и др., 2003);
- определение активности ферментов углеводного метаболизма – гликогенсинтетазы и глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (Кузнецова, 1998; Кузнецова и др., 2004);
- определения содержания белков методом Лоури;
- создания моделей экспериментального диабета 1-го и 2-го типов у позвоночных (Ping et al., 1999 с нашими модификациями) и диабетоподобного состояния у беспозвоночных (Плеснева и др., 2006; Кузнецова и др., 2007) с использованием стрептозотоцина.
- статистические методы обработки данных по программам (Statgraph и Anova).
