Принципиальная последовательность операций в этом методе представлена на рис 7. Связанные с носителем и биотинилированные моноклональные антитела инкубировали с пробой или стандартами. По завершении иммунологической реакции последовательно добавляли или стрептавидин и биотинилированную щелочную фосфатазу, или ацетилированный авидин и биотинилированную глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу. В зависимости от фермента величину сигнала регистрировали спектрофотометрически или по интенсивности люминесценции. Примером такого подхода может служить определение hGH с помощью иммобилизованных на полистирольных гранулах моноклональных антител анти-hGH и модифицированных длинноцепочечным производным биотина антител анти-hGH клона №69. Гранулы отмывали и последовательно инкубировали при комнатной температуре со стрептавидином и длинноцепочечным производным биотинилированной щелочной фосфатазы. После промывки добавляли раствор j-нитрофенилфрсфата. Образование продукта регистрировали по поглощению при 405 нм. Калибровочный график для определения hGH, полученный с помощью биотинилированной щелочной фосфатазы и спектрофотометрического определения продукта ферментативной реакции, представлен на рис. 8.
Чувствительность анализа сравнима с чувствительностью методов типа РИА. Коэффициент вариации внутри серии при анализе смешанной плазмы с концентрацией hGH 7.6–10"3 м.ед./л равен 6,5%, а коэффициент вариации между сериями при анализе того же пула – 7,4%.
На рис. 9 приведены результаты анализа образцов плазмы, взятых у пациентов, подвергнутых тесту «на стимуляцию секреции гормона роста. Полученные данные свидетельствуют, что с помощью этого метода можно регистрировать и количественно определять реакцию в тестах по стимуляции и подавлению синтеза hGH, проводимых для оценки резервов гормона в гипофизе. Все применявшиеся в этом методе реагенты устойчивы в течение по меньшей мере двух лет. Диапазон калибровочной кривой позволяет определять в одном анализе высокие и низкие концентрации hGH.
Заключение
Сравнительные данные для двух методов двухцентрового иммунометрического анализа hGH приведены в табл. 2. Чувствительность использованного для сравнения метода РИА составляла 0,6–10-3 м.ед./л, а рабочий диапазон – 10-3м.ед./л.
